Тъй като вирусът, причиняващ болестта COVID-19, се разпространи по цялото земно кълбо Международната агенция за атомна енергия (IAEA) в партньорство с Организацията по храните и земеделието в САЩ (FAO) предлагат на страните своята поддръжка и опит в използването на реакцията за „обратна транскрипция” на полимеразния тест ПСР (real time RT-PCR), реализуем в реално време, който е един от най-точните методи за откриване, проследяване и проучване на коронавирус.
КАКВО Е RT-PCR (РТ-ПСР) В РЕАЛНО ВРЕМЕ?
Това е метод, получен по ядрен път, който се използва за откриването на специфичен генетичен материал от всеки патоген, включително вирус. Оригиналният метод за откриването на таргетния (прицелния) генетичен материал използва радиоактивни изотопни маркери, но последващото усъвършенстване на метода е довело до замяната им със специални маркери, най-често флуоресцентни пигменти. С тази техника учените могат да отчетат резултатите веднага, още по време на протичането на самия процес, докато конвенционалната РТ-ПСР показва резултатите на края.
Понастоящем отчитаният в реално време РТ-ПСР метод е най-широко използваният тест за коронавирус, но все още много страни се нуждаят от помощ за внедряването и прилагането на тази техника.
КАКВО ОЗНАЧАВАТ ПОНЯТИЯТА ВИРУС И ГЕНЕТИЧЕН МАТЕРИАЛ?
Нагледно вирусът е микроскопично образувание, състоящо се от вирусния геном (ДНК или РНК) и неговата протеинова обвивка.
ДНК е двуверижна молекула, откривана във всеки организъм, като например животни, растения, вируси, която съхранява генетичния код или копие за устройството и развитието на тези организми.
РНК е едноверижна молекула, която копира, възпроизвежда и прехвърля части от генетичния код върху някои протеини, така че те да могат да синтезират и поддържат онези функции на организма, които са необходими за неговия живот и развитие.
Някои вируси, какъвто е коронавирус (SARS – Cov2), съдържат само РНК, което значи, че тяхното размножаване и преживяемост зависят единствено от инфилтрирането им в здравите клетки на приемника. След навлизането си в клетката, коронавирусът използва собствената си РНК, за да я препрограмира така, че да я превърне във вирус създаващ фактор.
За да може по метода RT-PCR в реално време един вирус, какъвто е коронавируса, да бъде открит рано в тялото, се изисква превръщането на РНК в ДНК. Този процес е наречен „обратна транскрипция” и се налага защото само ДНК може да бъде копирана или умножавана, което е ключът към тази реакция, откриваща вируса в реално време.
Учените намножават стотици, хиляди пъти една специфична част от възпроизвежданата вирусна ДНК. Тази амплификация (увеличение на броя) е важна, защото осигурява достатъчно голямо количество от таргетната част на вирусната ДНК, необходима като убедително доказателство за наличието на вируса.
RT-PCR В РЕАЛНО ВРЕМЕ ПРИ КОРОНАВИРУС
За това изследване се взима проба от такава част на тялото, където има струпване на коронавирус, каквито се носът и гърлото. Тази проба се третира с няколко химикала, които отстраняват протеините и мазнините, като извличат само наличната РНК. Така екстрахираната РНК е смес от РНК на приемника и коронавируса, ако има такъв.
Чрез специфичен ензим РНК бива подложена на „обратна транскрипция” (генериране на ДНК от РНК), след което се добавят нови количества от къси ДНК фрагменти, които са комплиментарни (допълнителни) към специфични части на копираната ДНК. Тези фрагменти се прикрепват към прицелни места на вирусната ДНК (ако има такава). По време на амплификацията някои от добавените генетични фрагменти се използват за изграждането на ДНК вериги, а останалите – за изграждане на ДНК и фиксиране на маркери към неговите вериги, които служат за откриване на вируса.
Така получената смес по-нататък е подложена на цикли на повишаване на температурата и охлаждане, с цел да стартира определени химични реакции, създаващи нови идентични копия от прицелните секции на вирусната ДНК. Цикълът се повтаря отново и отново, като всеки цикъл удвоява първоначалното количество: двете копия стават четири, четирите – осем и т.н. Стандартният РТ-ПСР тест обикновено включва 35 цикъла, което значи, че в края на този процес от всяка верига на ДНК са създадени по 35 билиона нови копия от желаните ДНК сектори на вируса, който се изследва.
След получаването на новите прицелни сегменти на вирусната ДНК и прикрепването към тях на флуоресциращите маркери, вграденият в уреда компютър анализира процесът на флуоресценция и в реално време извежда получените резултати на екран. Интензитетът на получената флуоресценция се следи от компютъра при всеки цикъл на измерване. Превишаването на определени нива потвърждава наличието на вируса. С цел да се прецени тежестта на инфекцията се отчита и броят на циклите, необходими за достигане на това ниво: по-малкият брой цикли, говори за по- голяма тежест на инфекцията.
ЗАЩО ДА ПРИЛАГАМЕ ТЕСТЪТ RT-PCR В РЕАЛНО ВРЕМЕ?
Тази специфична ТЕХНИКА е силно чувствителна и може да даде достоверна диагноза в рамките на три часа. За целта на обикновените лаборатории са необходими 6-8 часа. Сравнен с други достъпни методи за изолиране на вируса, RT-PCR в реално време е значително по-бърз и предполага по-малка опасност от замърсяване (контаминация) или грешки, тъй като целият процес протича в един затворен обем. И понастоящем този метод продължава да бъде най-прецизният, достъпен за откриване на коронавирус.
За откриване на старите инфекции, важни за разбиране на развитието и разпространението на вируса, реакцията RT-PCR в реално време не може да бъде използвана, тъй като вирусът присъства в тялото само в определен промеждутък от време. За откриване, проследяване и проучване на преминалите инфекции са необходими други методи, особено за безсимптомно разпространилите се случаи.
Превод от английски
Д-р Евгения МАРКОВА
